1　范圍
本規(guī)程規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)車間、菌種、發(fā)酵增殖、后處理、包裝、儲運及質(zhì)量檢驗等技術(shù)環(huán)節(jié)作出要求。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品。
2　規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB 3095-1996 環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
GB 3838-2002  地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
3　生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)車間要求
3.1　生產(chǎn)環(huán)境
—— 廠區(qū)空氣質(zhì)量達(dá)到大氣環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3095-1996中Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)要求；
—— 發(fā)酵用水達(dá)到地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3838-2002中Ⅲ類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)中Ⅳ類水質(zhì)要求；
3.2　生產(chǎn)車間
—— 發(fā)酵車間與吸附等后處理車間距離適當(dāng)，相對隔離，有密閉且可以滅菌的傳輸通道；
—— 菌種的儲藏間、無菌操作間與生產(chǎn)車間相對隔離；
—— 發(fā)酵等生產(chǎn)關(guān)鍵性車間采用雙路供電或備用一套發(fā)電機。
—— 建立定期用消毒劑進行生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的車間環(huán)境衛(wèi)生制度。
4　生產(chǎn)技術(shù)流程
農(nóng)用微生物菌劑的一般生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)為：菌種→種子擴培→發(fā)酵培養(yǎng)→后處理→包裝→產(chǎn)品質(zhì)量檢驗→出廠。流程圖見附錄A。
4.1　菌種
4.1.1　原種
原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種的要求如下：
—— 有菌種鑒定報告；
—— 菌種的企業(yè)編號、來源等信息。
4.1.2　菌種的保存和管理
—— 采用合適的方式保存菌種，確保無雜菌污染，菌種不退化。應(yīng)選用一種以上適宜的方法保藏，常見菌種類型及相應(yīng)保藏方式見附錄B；
—— 分類存放，定期檢查；
—— 建立菌種檔案。
4.1.3　菌種質(zhì)量控制
在生產(chǎn)之前，應(yīng)對所用菌種進行檢查，確認(rèn)其純度和應(yīng)用性能沒有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，需進行4.1.4或4.1.5操作。
4.1.4　菌種的純化
菌種不純時，應(yīng)進行純化?？刹捎闷桨鍎澗€分離法或稀釋分離法，得到純菌種。必要時可采用顯微操作單細(xì)胞分離器進行菌種分離純化。
對純化的菌種應(yīng)進行生產(chǎn)性能的檢查。
4.1.5　菌種的復(fù)壯
菌種發(fā)生下列現(xiàn)象之一，應(yīng)進行菌種復(fù)壯：
—— 菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化；
—— 代謝活性降低，發(fā)酵周期改變；
—— 重要功能性物質(zhì)的產(chǎn)生能力下降；
—— 其他重要特性的退化或喪失；
菌種復(fù)壯方法：回接到原宿主或原分離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新分離該菌種。
4.2　發(fā)酵增殖
4.2.1　種子擴培
原菌種應(yīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接活化至生長旺盛后方可應(yīng)用。
種子擴培過程包括試管斜面菌種、搖瓶（或固體種子培養(yǎng)瓶）、種子罐發(fā)酵（或種子固體發(fā)酵）培養(yǎng)三個階段，操作過程要保證菌種不被污染、生長旺盛。
4.2.2　培養(yǎng)基
培養(yǎng)基重要原料應(yīng)滿足一定的質(zhì)量要求，包括成分、含量、有效期以及產(chǎn)地等。對新使用的發(fā)酵原料需經(jīng)搖瓶試驗或小型發(fā)酵罐試驗后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。
4.2.2.1　種子培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基要保證菌種生長延滯期短，生長旺盛。原料應(yīng)使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營養(yǎng)豐富完全，有較強的pH緩沖能力。最后一級種子培養(yǎng)基主要成分應(yīng)接近發(fā)酵培養(yǎng)基。
4.2.2.2　發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長旺盛，在保證一定菌體（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顧有效代謝產(chǎn)物。原料應(yīng)選用來源充足、價格便宜且易于利用的營養(yǎng)物質(zhì)，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低。
可采用對發(fā)酵培養(yǎng)基補料流加的方法改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成以達(dá)到高產(chǎn)。
4.2.3　滅菌
常用的滅菌方式及適用對象見附錄C。
4.2.3.1　高壓蒸汽滅菌操作要求
a)    液體培養(yǎng)基、補料罐（包括消泡劑）、管道、發(fā)酵設(shè)備及空氣過濾系統(tǒng)滅菌溫度為121℃~125℃(壓力0.103Mpa~ 0.168Mpa)，0.5h~1.0h。液體培養(yǎng)基裝料量為50%~75%發(fā)酵罐容積。
b)    固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121℃~130℃，1.0h ~2.0h；或采用100℃滅菌2h~4h，24h后再滅菌一次。
c)    在高溫滅菌會產(chǎn)生對菌體生長有害物質(zhì)或?qū)σ资芨邷仄茐奈锪蠝缇鷷r，應(yīng)采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長時間。
培養(yǎng)基滅菌后按4.2.3.2進行檢查。若滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。
4.2.3.2　滅菌效果檢查
采用顯微鏡染色觀察法和/或發(fā)酵管試驗法檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。
4.2.3.2.1　染色觀察法
a)     對待檢測培養(yǎng)基無菌操作取樣，在潔凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。
b)     若鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認(rèn)為滅菌不徹底，需要進行4.2.3.2.2操作，無活菌體后培養(yǎng)基方可使用。
c)     若未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認(rèn)為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時,可進行4.2.3.2.2操作，以進一步確認(rèn)培養(yǎng)基滅菌徹底。
4.2.3.2.2　發(fā)酵管試驗法
用無菌操作技術(shù)將1mL供試培養(yǎng)基加至5mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，重復(fù)三次。置于37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即可認(rèn)為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。
4.2.4　無菌空氣
發(fā)酵生產(chǎn)中所通入的無菌空氣采用過濾除菌設(shè)備制得，空氣過濾系統(tǒng)應(yīng)采用二級以上過濾。對制得的無菌空氣按如下步驟檢驗合格后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。
用無菌操作技術(shù)，向裝有100mL～200mL無菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測濾過空氣10min～15min。三角瓶置于37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即判定合格。
4.3　發(fā)酵控制
4.3.1　接種量的要求
—— 搖瓶種子轉(zhuǎn)向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為0.5%～5%；
—— 在多級發(fā)酵生產(chǎn)階段，對生長繁殖快的菌種（代時<3h），從一級轉(zhuǎn)向下一級發(fā)酵的接種量為5%~10%；對生長繁殖較慢的菌種（代時>6h），接種量不低于10%。
4.3.2　培養(yǎng)溫度
發(fā)酵溫度應(yīng)控制在25℃~35℃，對特殊類型的菌種應(yīng)根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過程中，可根據(jù)菌體的生長代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。
4.3.3　供氧
通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補充無菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。
對于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界氧濃度；嚴(yán)格厭氧類型菌株培養(yǎng)基的氧化還原電位不得高于其臨界氧化還原電位。
4.3.4　物料含水量
固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為50%~60%。發(fā)酵結(jié)束時，應(yīng)控制在20%~40%。
4.3.5　發(fā)酵終點判斷
下列參數(shù)為發(fā)酵終點判定依據(jù)：
—— 鏡檢觀察菌體的形態(tài)、密度,要求芽胞菌發(fā)酵結(jié)束時芽胞形成率≥80%；
—— 監(jiān)測發(fā)酵液中還原糖、總糖、氨基氮、pH值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)；
—— 監(jiān)測發(fā)酵過程中攝氧率、CO2產(chǎn)生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)；
—— 固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。
4.4　后處理
后處理過程可分為發(fā)酵物同載體（或物料）混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類型。
4.4.1　發(fā)酵物同載體(或物料)混合吸附
對載體及物料的要求如下：
—— 載體的雜菌數(shù)≤1.0×104個/ g；
—— 細(xì)度、有毒有害元素（Hg、Pb、Cd、Cr、 As）含量、pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲卵死亡率值達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求；
—— 有利于菌體（或芽胞、孢子）的存活。
發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護劑或采取適當(dāng)措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應(yīng)注意無菌控制,避免雜菌污染。
4.4.2　發(fā)酵物直接分裝
對于發(fā)酵物直接分裝的產(chǎn)品劑型，可根據(jù)產(chǎn)品要求進行包裝。
4.5　建立生產(chǎn)檔案
每批產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗結(jié)果應(yīng)存檔記錄，包括檢驗項目、檢驗結(jié)果、檢驗人、批準(zhǔn)人、檢驗日期等信息。
4.6　產(chǎn)品質(zhì)量跟蹤
定期檢查產(chǎn)品質(zhì)量，并對產(chǎn)品建立應(yīng)用檔案，跟蹤產(chǎn)品的應(yīng)用情況。
　
                     附　錄　A
                     （資料性附錄）
農(nóng)用微生物制劑生產(chǎn)工藝流程示意圖（略）
　
                       附 錄 B
                    （資料性附錄）
               農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中菌種的常用保藏方式

附 錄 C
                   （資料性附錄）
          農(nóng)用微生物制劑的生產(chǎn)中常用滅菌方法及適用對象