1　范圍
本規(guī)程規(guī)定了農用微生物菌劑生產中所涉及的生產環(huán)境、生產車間、菌種、發(fā)酵增殖、后處理、包裝、儲運及質量檢驗等技術環(huán)節(jié)作出要求。
本標準適用于農用微生物菌劑產品。
2　規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。
GB 3095-1996 環(huán)境空氣質量標準
GB 3838-2002  地表水質量標準
3　生產環(huán)境及生產車間要求
3.1　生產環(huán)境
—— 廠區(qū)空氣質量達到大氣環(huán)境質量標準GB 3095-1996中Ⅱ類標準要求；
—— 發(fā)酵用水達到地表水質量標準GB 3838-2002中Ⅲ類水質要求，冷卻水及其他用水達到標準中Ⅳ類水質要求；
3.2　生產車間
—— 發(fā)酵車間與吸附等后處理車間距離適當，相對隔離，有密閉且可以滅菌的傳輸通道；
—— 菌種的儲藏間、無菌操作間與生產車間相對隔離；
—— 發(fā)酵等生產關鍵性車間采用雙路供電或備用一套發(fā)電機。
—— 建立定期用消毒劑進行生產設備和環(huán)境消毒的車間環(huán)境衛(wèi)生制度。
4　生產技術流程
農用微生物菌劑的一般生產技術環(huán)節(jié)為：菌種→種子擴培→發(fā)酵培養(yǎng)→后處理→包裝→產品質量檢驗→出廠。流程圖見附錄A。
4.1　菌種
4.1.1　原種
原種是生產用菌種的母種，對原種的要求如下：
—— 有菌種鑒定報告；
—— 菌種的企業(yè)編號、來源等信息。
4.1.2　菌種的保存和管理
—— 采用合適的方式保存菌種，確保無雜菌污染，菌種不退化。應選用一種以上適宜的方法保藏，常見菌種類型及相應保藏方式見附錄B；
—— 分類存放，定期檢查；
—— 建立菌種檔案。
4.1.3　菌種質量控制
在生產之前，應對所用菌種進行檢查，確認其純度和應用性能沒有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作為生產用菌種，需進行4.1.4或4.1.5操作。
4.1.4　菌種的純化
菌種不純時，應進行純化?？刹捎闷桨鍎澗€分離法或稀釋分離法，得到純菌種。必要時可采用顯微操作單細胞分離器進行菌種分離純化。
對純化的菌種應進行生產性能的檢查。
4.1.5　菌種的復壯
菌種發(fā)生下列現(xiàn)象之一，應進行菌種復壯：
—— 菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化；
—— 代謝活性降低，發(fā)酵周期改變；
—— 重要功能性物質的產生能力下降；
—— 其他重要特性的退化或喪失；
菌種復壯方法：回接到原宿主或原分離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新分離該菌種。
4.2　發(fā)酵增殖
4.2.1　種子擴培
原菌種應連續(xù)轉接活化至生長旺盛后方可應用。
種子擴培過程包括試管斜面菌種、搖瓶（或固體種子培養(yǎng)瓶）、種子罐發(fā)酵（或種子固體發(fā)酵）培養(yǎng)三個階段，操作過程要保證菌種不被污染、生長旺盛。
4.2.2　培養(yǎng)基
培養(yǎng)基重要原料應滿足一定的質量要求，包括成分、含量、有效期以及產地等。對新使用的發(fā)酵原料需經搖瓶試驗或小型發(fā)酵罐試驗后方可用于發(fā)酵生產。
4.2.2.1　種子培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基要保證菌種生長延滯期短，生長旺盛。原料應使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營養(yǎng)豐富完全，有較強的pH緩沖能力。最后一級種子培養(yǎng)基主要成分應接近發(fā)酵培養(yǎng)基。
4.2.2.2　發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長旺盛，在保證一定菌體（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顧有效代謝產物。原料應選用來源充足、價格便宜且易于利用的營養(yǎng)物質，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低。
可采用對發(fā)酵培養(yǎng)基補料流加的方法改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成以達到高產。
4.2.3　滅菌
常用的滅菌方式及適用對象見附錄C。
4.2.3.1　高壓蒸汽滅菌操作要求
a)    液體培養(yǎng)基、補料罐（包括消泡劑）、管道、發(fā)酵設備及空氣過濾系統(tǒng)滅菌溫度為121℃~125℃(壓力0.103Mpa~ 0.168Mpa)，0.5h~1.0h。液體培養(yǎng)基裝料量為50%~75%發(fā)酵罐容積。
b)    固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121℃~130℃，1.0h ~2.0h；或采用100℃滅菌2h~4h，24h后再滅菌一次。
c)    在高溫滅菌會產生對菌體生長有害物質或對易受高溫破壞物料滅菌時，應采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長時間。
培養(yǎng)基滅菌后按4.2.3.2進行檢查。若滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。
4.2.3.2　滅菌效果檢查
采用顯微鏡染色觀察法和/或發(fā)酵管試驗法檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。
4.2.3.2.1　染色觀察法
a)     對待檢測培養(yǎng)基無菌操作取樣，在潔凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。
b)     若鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認為滅菌不徹底，需要進行4.2.3.2.2操作，無活菌體后培養(yǎng)基方可使用。
c)     若未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時,可進行4.2.3.2.2操作，以進一步確認培養(yǎng)基滅菌徹底。
4.2.3.2.2　發(fā)酵管試驗法
用無菌操作技術將1mL供試培養(yǎng)基加至5mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，重復三次。置于37℃培養(yǎng)，24h內無渾濁、鏡檢無菌體即可認為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。
4.2.4　無菌空氣
發(fā)酵生產中所通入的無菌空氣采用過濾除菌設備制得，空氣過濾系統(tǒng)應采用二級以上過濾。對制得的無菌空氣按如下步驟檢驗合格后方可用于發(fā)酵生產。
用無菌操作技術，向裝有100mL～200mL無菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測濾過空氣10min～15min。三角瓶置于37℃培養(yǎng)，24h內無渾濁、鏡檢無菌體即判定合格。
4.3　發(fā)酵控制
4.3.1　接種量的要求
—— 搖瓶種子轉向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為0.5%～5%；
—— 在多級發(fā)酵生產階段，對生長繁殖快的菌種（代時<3h），從一級轉向下一級發(fā)酵的接種量為5%~10%；對生長繁殖較慢的菌種（代時>6h），接種量不低于10%。
4.3.2　培養(yǎng)溫度
發(fā)酵溫度應控制在25℃~35℃，對特殊類型的菌種應根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過程中，可根據(jù)菌體的生長代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。
4.3.3　供氧
通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補充無菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。
對于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界氧濃度；嚴格厭氧類型菌株培養(yǎng)基的氧化還原電位不得高于其臨界氧化還原電位。
4.3.4　物料含水量
固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為50%~60%。發(fā)酵結束時，應控制在20%~40%。
4.3.5　發(fā)酵終點判斷
下列參數(shù)為發(fā)酵終點判定依據(jù)：
—— 鏡檢觀察菌體的形態(tài)、密度,要求芽胞菌發(fā)酵結束時芽胞形成率≥80%；
—— 監(jiān)測發(fā)酵液中還原糖、總糖、氨基氮、pH值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)；
—— 監(jiān)測發(fā)酵過程中攝氧率、CO2產生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)；
—— 固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。
4.4　后處理
后處理過程可分為發(fā)酵物同載體（或物料）混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類型。
4.4.1　發(fā)酵物同載體(或物料)混合吸附
對載體及物料的要求如下：
—— 載體的雜菌數(shù)≤1.0×104個/ g；
—— 細度、有毒有害元素（Hg、Pb、Cd、Cr、 As）含量、pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲卵死亡率值達到產品質量標準要求；
—— 有利于菌體（或芽胞、孢子）的存活。
發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護劑或采取適當措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應注意無菌控制,避免雜菌污染。
4.4.2　發(fā)酵物直接分裝
對于發(fā)酵物直接分裝的產品劑型，可根據(jù)產品要求進行包裝。
4.5　建立生產檔案
每批產品的生產、檢驗結果應存檔記錄，包括檢驗項目、檢驗結果、檢驗人、批準人、檢驗日期等信息。
4.6　產品質量跟蹤
定期檢查產品質量，并對產品建立應用檔案，跟蹤產品的應用情況。
　
                     附　錄　A
                     （資料性附錄）
農用微生物制劑生產工藝流程示意圖（略）
　
                       附 錄 B
                    （資料性附錄）
               農用微生物菌劑生產中菌種的常用保藏方式

附 錄 C
                   （資料性附錄）
          農用微生物制劑的生產中常用滅菌方法及適用對象